Polimeraza eta i inosyna: nowy mechanizm mutagenny w komórkach raka

Czy podwyższony poziom inosyny aktywuje specyficzne mechanizmy naprawy DNA?

Inosyna, nukleozyd purynowy o zasadzie hipoksantynowej, stanowi kluczowy związek pośredni w wielu szlakach metabolicznych, w tym w biosyntezach puryn. Najnowsze badania wskazują, że inosyna może być produkowana przez mikrobiom jelitowy i jest ściśle związana z układem odpornościowym oraz stanem zapalnym. Co więcej, podwyższone poziomy inosyny i jej metabolitów, takich jak monofosforan inosyny (IMP), obserwowano w różnych schorzeniach nowotworowych – w tym w raku płaskonabłonkowym płuc, przełyku, głowy i szyi oraz w raku pęcherza moczowego.

Szczególnie istotne jest to, że inosyna może być wbudowywana do DNA i RNA, co prowadzi do potencjalnie mutagennych zmian. Zwiększone poziomy inosyny obserwowano także w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z ostrym i przewlekłym bólem oraz w surowicy chorych na fibromialgię. Mimo że mechanizmy naprawy DNA, takie jak naprawa przez wycięcie rybonukleotydów (RER) inicjowana przez RNase H2, są w stanie usuwać wbudowane rybonukleotydy, rola poszczególnych polimeraz DNA w tym procesie pozostaje niejasna.

Która polimeraza odpowiada na wzrost poziomu inosyny w komórkach nowotworowych?

Badanie przeprowadzone na linii komórkowej HCT116 (ludzki rak jelita grubego) za pomocą RT-qPCR wykazało, że polimeraza eta (polη) jest jedną z dwóch głównych polimeraz DNA, których ekspresja wzrasta w odpowiedzi na 3-krotne podanie inosyny lub IMP. Zarówno przy stężeniu 10 µM, jak i 100 µM, obserwowano około 3-krotny wzrost ekspresji polη, przy czym nie zanotowano istotnych różnic między obiema dawkami. Jest to zaskakujące, biorąc pod uwagę 10-krotną różnicę w stężeniach.

Druga polimeraza, której ekspresja wzrosła, to polimeraza delta (polδ) – jedna z replikacyjnych polimeraz DNA. W jej przypadku poziom wzrostu ekspresji był znacząco wyższy przy stężeniu 100 µM niż przy 10 µM, co sugeruje, że komórki HCT116 wykorzystują polη i polδ w odmienny sposób w odpowiedzi na podwyższony poziom inosyny. Co istotne, inne polimerazy translekcyjne (TLS), takie jak polimeraza iota (polι) i kappa (polκ), nie wykazały znaczącego wzrostu ekspresji, co może wskazywać, że polη jest jedyną polimerazą TLS zaangażowaną w wbudowywanie i omijanie inosyny w komórkach HCT116.

Jak wielokrotne podanie inosyny wpływa na cykl komórkowy?

Analiza cytometryczna przeprowadzona na komórkach HCT116 wykazała, że 5-krotne podanie inosyny lub IMP wywołuje zatrzymanie cyklu komórkowego w fazach S i G2. W porównaniu do komórek nieleczonych (faza S: 14,0%, faza G2: 11,9%), po 5-krotnym leczeniu inosyną zaobserwowano wzrost populacji komórek w fazie S do 26,1% oraz w fazie G2 do 30,0%. Analogiczne wyniki uzyskano przy leczeniu IMP (S: 26,9%, G2: 32,3%).

Zatrzymanie w fazie S i G2 sugeruje, że nagromadzenie inosyny w DNA może zakłócać replikację i prowadzić do aktywacji punktów kontrolnych cyklu komórkowego. Jest to szczególnie istotne w kontekście szybko dzielących się komórek nowotworowych, gdzie zapotrzebowanie na nukleotydy jest wysokie, a mechanizmy naprawy DNA mogą być przeciążone. Warto zaznaczyć, że efekt ten obserwowano dopiero po 5-krotnym leczeniu – 1- i 3-krotne podania nie wykazały tego zjawiska.

Jak efektywnie polη wbudowuje rybonukleotyd inosyny do DNA?

Badania kinetyczne wykazały, że polη wbudowuje ITP (trifosforanową formę inosyny) naprzeciwko dC z wydajnością katalityczną (k_cat/K_m) wynoszącą 0,02. Dla porównania, wbudowywanie dITP (deoksyinozynotrifosforanu) naprzeciwko dC wykazuje k_cat/K_m równe 7,17, co oznacza około 360-krotnie wyższą efektywność w przypadku postaci dezoksyrybozowej. Mimo to, wbudowywanie ITP przez polη jest znacząco bardziej efektywne niż wbudowywanie kanonicznych rybonukleotydów – dla GTP naprzeciwko dC k_cat/K_m wynosi zaledwie 0,0073, a dla dGTP aż 18,5 (różnica 2540-krotna).

Co istotne, polη była w stanie wbudować ITP również naprzeciwko dT (k_cat/K_m = 0,0011), co stanowi błędną inkorporację mogącą prowadzić do mutacji A:T → G:C. Stosunek efektywności między prawidłowym (dC:ITP) a nieprawidłowym (dT:ITP) wbudowywaniem wynosi około 18:1, co jest porównywalne do stosunku 14:1 dla dITP. To sugeruje, że wbudowywanie ITP przez polη jest promutagenne, szczególnie w porównaniu do kanonicznych rybonukleotydów, które nie były wbudowywane w sposób błędny.

Jak polη rozpoznaje i wbudowuje ITP w swoim centrum aktywnym?

Struktury krystalograficzne kompleksów polη z ITP ujawniły mechanizm molekularny wbudowywania rybonukleotydu inosyny. W kompleksie polη-dC:ITP zasada hipoksantynowa ITP tworzy nieoptymalne pary Watsona-Cricka z dC, z odległością 4,0 Å między N4 dC a O6 ITP (zamiast klasycznego wiązania wodorowego występuje oddziaływanie van der Waalsa). Wynika to z obecności grupy 2′-OH w pierścieniu rybozowym ITP, która powoduje niewielkie odchylenie płaszczyzny zasady hipoksantynowej względem dC.

W przypadku kompleksu polη-dT:ITP struktury krystalograficzne ujawniły dwie odmienne konformacje ITP: anti i syn. W konformacji anti ITP tworzy parę przypominającą Watsona-Cricka z tymidyną za pośrednictwem tautomeru 4-enol-2-keto tyminy (odległość wiązania wodorowego: 3,2 Å). W konformacji syn ITP tworzy parę wobble z dT, z wiązaniem wodorowym między N3 dT a N7 ITP (odległość: 2,8 Å). Ta zmienność konformacyjna ITP umożliwia polη błędne wbudowanie ITP naprzeciwko dT, czego nie obserwowano dla kanonicznych purynowych rybonukleotydów (ATP, GTP).

We wszystkich trzech strukturach zaobserwowano obecność tylko jednego jonu wapnia w centrum aktywnym (brak jonu w miejscu A), co może być charakterystyczną cechą wbudowywania rybonukleotydów przez polη. Odległość 3′-OH końca startera od Pα ITP wynosiła 4,4 Å (dC:ITP), 4,2 Å (dT:ITP anti) i 3,9 Å (dT:ITP syn), co wskazuje na mniej optymalne ustawienie do nukleofilowego ataku w porównaniu do wbudowywania deoksyrybonukleotydów.

Czy inosyna i IMP wpływają na szlaki biosyntezy nukleotydów?

Analiza RT-qPCR wykazała wzrost ekspresji niektórych genów zaangażowanych w metabolizm nukleotydów po 3-krotnym leczeniu inosyną lub IMP. Hydroksymetylotransferaza serynowa (SHMT) – kluczowy enzym w metabolizmie jednego węgla i biosyntezie pirymidyn – została aktywowana w formach cytozolowej (SHMT-1) i mitochondrialnej (SHMT-2) zarówno przy stężeniu 10 µM, jak i 100 µM (z wyższą ekspresją przy 100 µM). SHMT był jedynym enzymem cyklu tymidylanowego, którego ekspresja wzrosła w odpowiedzi na leczenie.

Syntaza monofosforanu guanozyny (GMPS), enzym zaangażowany w biosyntezę puryn, wykazała jedynie niewielki wzrost ekspresji. To sugeruje, że egzogennie dodana inosyna lub IMP nie angażują się bezpośrednio w biosyntezę puryn, lecz są najpierw metabolizowane w komórkach. Interesujące jest również to, że polimeraza beta (polβ), kluczowy enzym naprawy przez wycięcie zasad (BER), wykazała nieznaczny wzrost ekspresji po leczeniu IMP, ale nie po leczeniu inosyną. Inne geny BER, takie jak glikozylaza uracylowa DNA (UDG-1) czy białko wiążące metylowane CpG (MBD4), nie wykazały znaczących zmian ekspresji.

Jakie są potencjalne zastosowania terapeutyczne tych odkryć?

Wyniki badania sugerują, że polη może pełnić rolę modulatora zatrzymania cyklu komórkowego w fazach S i G2, wywołanego przez leki wbudowujące się do DNA. W kontekście klinicznym hamowanie polη mogłoby potencjalnie przedłużyć zatrzymanie cyklu komórkowego wywołane przez leki chemioterapeutyczne, takie jak gemcytabina czy 6-tiopuryny. Efekt ten może być szczególnie wyraźny w środowisku, gdzie mechanizmy naprawy DNA nie funkcjonują w pełni, jak w szybko dzielących się komórkach nowotworowych.

Obecnie zatwierdzone przez FDA leki wywołujące zatrzymanie cyklu komórkowego obejmują inhibitory CDK (np. rybocyklib, zatrzymanie G1/S), inhibitory mikrotubul (np. docetaksel, zatrzymanie G2/M) oraz czynniki uszkadzające DNA (np. doksorubicyna, zatrzymanie G1, S, G2/M). Modulacja aktywności polη mogłaby stanowić nowe podejście terapeutyczne, szczególnie w nowotworach jelita grubego, gdzie polη wykazuje selektywny wzrost ekspresji w odpowiedzi na podwyższony poziom inosyny.

Należy jednak podkreślić, że badanie to zostało przeprowadzone wyłącznie na linii komórkowej HCT116, co ogranicza możliwość uogólnienia wyników. Konieczne są dalsze badania na modelach in vivo oraz potwierdzenie nadekspresji polη metodą Western blot. Ponadto nie jest jasne, czy mechanizm zaangażowania polη w wbudowywanie i omijanie inosyny jest uniwersalny dla różnych typów komórek nowotworowych czy też specyficzny dla raka jelita grubego.

Co to oznacza dla zrozumienia mutagenności w komórkach nowotworowych?

Badanie dostarcza nowych dowodów na to, że polimeraza eta (polη) odgrywa kluczową rolę w wbudowywaniu inosyny do DNA oraz w wywoływaniu zatrzymania cyklu komórkowego w fazach S i G2. Wzrost ekspresji polη w odpowiedzi na podwyższony poziom inosyny lub IMP, w połączeniu z jej zdolnością do błędnego wbudowywania ITP naprzeciwko dT, wskazuje na potencjalnie wysoką mutagenność tego procesu. Struktury krystalograficzne ujawniły, że zmienność konformacyjna ITP (anti i syn) umożliwia polη wbudowywanie tego rybonukleotydu w sposób bardziej efektywny niż kanonicznych rybonukleotydów. Zatrzymanie cyklu komórkowego obserwowane po 5-krotnym leczeniu inosyną lub IMP sugeruje, że nagromadzenie inosyny w DNA może prowadzić do aktywacji punktów kontrolnych replikacji. Modulacja aktywności polη mogłaby stanowić nowy cel terapeutyczny w leczeniu nowotworów, szczególnie w połączeniu z lekami wbudowującymi się do DNA.