Modyfikacja RNA A-to-I: mechanizm, znaczenie i rola w rozwoju nowotworów

Czym jest modyfikacja A-to-I i jakie enzymy ją katalizują?

Modyfikacja RNA typu adenozyna-do-inozyny (A-to-I) jest jedną z ponad 170 różnych modyfikacji RNA, które stanowią przedmiot badań nowej dziedziny nauki zwanej epitranskryptomiką. Proces ten, polegający na konwersji adenozyny (A) do inozyny (I), jest jedną z najbardziej powszechnych modyfikacji RNA, odkrytą ponad trzy dekady temu. Inozyna preferencyjnie łączy się z cytydyną (C), a podczas translacji jest odczytywana jako guanozyna (G), co umożliwia ekspresję różnych izoform białek z tego samego genu.

Modyfikacja A-to-I jest katalizowana przez trzy główne grupy enzymów: adenozynowe deaminazy działające na RNA (ADAR), adenozynowe deaminazy specyficzne dla tRNA (ADAT) oraz białka z rodziny zawierającej domenę deaminazy adenozynowej specyficznej dla jąder (ADAD). Mechanizm ten wpływa na przetwarzanie RNA, jego stabilność i translację, a zaburzenia w tym procesie są coraz częściej wiązane z rozwojem chorób nowotworowych.

W rodzinie ADAR u ssaków występują trzy geny: ADAR1, ADAR2 i ADAR3, różniące się strukturą, lokalizacją i funkcją. ADAR1 jest ekspresjonowany w większości tkanek i występuje w dwóch izoformach: krótszej, konstytutywnej, ograniczonej do jądra komórkowego (ADAR1 p110) oraz dłuższej, indukowanej przez interferon (ADAR1 p150), obecnej zarówno w jądrze jak i cytoplazmie. ADAR2 wykazuje bardziej ukierunkowaną ekspresję w tkankach takich jak mózg, płuca i tętnice, i odpowiada za wyższe wskaźniki edycji A-to-I w tkankach neuronalnych. ADAR3 jest specyficznie ekspresjonowany w ośrodkowym układzie nerwowym i jak dotąd nie wykazano jego aktywności edycyjnej, choć może hamować działanie innych ADAR-ów w mózgu.

Każdy ADAR posiada wspólne domeny funkcjonalne, w tym dwie lub trzy domeny wiążące dsRNA (dsRBD) oraz domenę deaminazy niezbędną do aktywności edycyjnej A-to-I. Lokalizacja ADAR-ów jest ściśle regulowana. ADAR1 p150 może przemieszczać się między jądrem a cytoplazmą, a eksport jądrowy jest zapośredniczony przez wiązanie czynnika eksportu jądrowego XPO1 do sekwencji NES zlokalizowanej w domenie Zα. Lokalizacja ADAR2 głównie w jąderku jest regulowana przez wiązanie KPNA1 i KPNA3 do bogatego w argininę sygnału lokalizacji jądrowej (NLS) w regionie N-końcowym.

Jak edycja A-to-I wpływa na funkcjonowanie różnych typów RNA?

Modyfikacje A-to-I występują również w tRNA. Metyloinozyna 37 (m¹I₃₇) jest wyłączna dla eukariotycznego tRNA^Ala i powstaje w dwuetapowym procesie, najpierw obejmującym modyfikację A-to-I katalizowaną przez homodimer ADAT1, a następnie metylację przez metylotransferazę tRNA 5 (Trm5). Modyfikacja A₃₄ tRNA jest powszechna zarówno u bakterii, jak i eukariontów. U eukariontów I₃₄ występuje w ośmiu tRNA, a konwersja A-to-I jest katalizowana przez heterodimer adenozynowej deaminazy składający się z podjednostki katalitycznej ADAT2 i podjednostki wiążącej tRNA ADAT3.

Rodzina białek ADAD specyficznych dla jąder, w tym ADAD1 i ADAD2, jest niezbędna dla męskiej płodności. ADAD1 jest ekspresjonowany w haploidalnych spermatydach, podczas gdy ADAD2 w spermatocytach w środkowej do późnej fazie pachytenu. Analiza domeny deaminazy adenozynowej ADAD sugeruje, że są one prawdopodobnie katalitycznie nieaktywne i mogą funkcjonować jako negatywne regulatory edycji RNA w męskich komórkach rozrodczych.

Edycja A-to-I w RNA może wpływać na różne funkcje w zależności od rodzaju RNA i miejsca modyfikacji. W przypadku mRNA, edycja A-to-I w regionie kodującym może prowadzić do mutacji niesynonimicznych, podczas gdy edycja w intronach lub 3′-UTR może modulować poziomy ekspresji powiązanych regionów kodujących. Większość miejsc edycji A-to-I znajduje się w intronach i 3′-UTR genów kodujących, przy czym 1% lub mniej występuje w eksonach kodujących.

Edycja A-to-I mRNA może zachodzić w eksonach, intronach i regionach 3′-UTR. Tylko niewielka część z milionów miejsc edycji RNA w ludzkim transkryptomie znajduje się w sekwencjach mRNA kodujących białka, przy czym zdecydowana większość występuje w sekwencjach niekodującego RNA w regionach niepodlegających translacji i intronach. Miejsca edycji niekodującego RNA u ludzi najczęściej obserwuje się w odwróconych elementach powtarzalnych Alu, w których dwa sąsiednie elementy Alu w przeciwnych orientacjach w tym samym transkrypcie tworzą dsRNA.

W przypadku tRNA, eukariotyczny ADAT deaminuje A₃₄ w wielu tRNA (osiem tRNA u ludzi). Funkcjonalnie, modyfikacja I₃₄-tRNA zwiększa elastyczność parowania wobble antykodonu, ponieważ I₃₄-tRNA może rozpoznawać zarówno kodony zakończone A, C, jak i U, podczas gdy A₃₄-tRNA może efektywnie łączyć się tylko z kodonami zakończonymi U. Główny wpływ modyfikacji A₃₄-tRNA A-to-I dotyczy wydajności translacji białek.

W jaki sposób edycja A-to-I przyczynia się do nowotworzenia?

Rola A-to-I w nowotworach jest znacząca. Adenozynowe deaminazy RNA, szczególnie ADAR, są nadekspresjonowane w guzach i nieprawidłowo katalizują modyfikację A-to-I, wpływając ostatecznie na ekspresję genów docelowych zaangażowanych w tumorogenezę lub modulację mikrośrodowiska guza.

ADAR1 jest nadekspresjonowany w wielu nowotworach i działa głównie jako onkogen, promując proliferację i migrację komórek. Wiele badań wykazało, że hiper-edycja A-to-I AZIN1, modulowana przez ADAR1, jest związana z tumorogenezą raka jelita grubego, raka endometrium, raka żołądka, raka wątroby i płaskonabłonkowego raka przełyku, a rekodowanie AZIN koreluje z gorszym rokowaniem. “Nasze badania jednoznacznie wskazują, że edycja AZIN1 przez ADAR1 prowadzi do nabycia przez komórki nowotworowe zdolności do inwazji i migracji, co bezpośrednio przekłada się na agresywność guza” – piszą autorzy badania.

Mechanistycznie, edycja A-to-I transkryptów AZIN1 prowadzi do substytucji seryny na glicynę w pozycji 367, która jest zlokalizowana w β-harmonijce 15 i przewiduje się, że powoduje zmianę konformacyjną promującą translokację AZIN z cytoplazmy do jądra oraz zwiększa stabilność białka. AZIN1 funkcjonuje jako czynnik onkogenny, który zwiększa zdolności proliferacji, inwazji i migracji komórek oraz cechy macierzystości nowotworowej, nadając fenotypy zyskujące funkcję ze zwiększonym potencjałem inicjowania guza i agresywnymi fenotypami.

ADAR1 wzmacnia również funkcję GLI1 poprzez edycję A-to-I, która prowadzi do zmiany argininy na glicynę w pozycji 701, co zwiększa aktywność transkrypcyjną GLI1 i tym samym fenotypy pro-tumorogenne w gruczolakoraku przewodowym trzustki. W raku tarczycy, modyfikacja CDK13 zależna od ADAR1 prowadzi do zmiany glutaminy na argininę w pozycji 103. Edytowane białko CDK13 było wzbogacone w jąderku i nadawało komórkom TC zwiększone właściwości proliferacji i migracji.

Jednakże częściej edycja A-to-I zależna od ADAR1 dezaktywuje supresory nowotworów, indukując progresję guza. ADAR1 jest krytycznym onkogenem dla potrójnie ujemnego raka piersi (TNBC). Substytucja metioniny przez walinę w pozycji 2,269 w filaminie B (FLNB) z powodu rekodowania przez ADAR1 znosi aktywności supresorowe nowotworu tego białka, prowadząc do progresji cyklu komórkowego i inwazji.

W przeciwieństwie do ADAR1, edycja A-to-I zależna od ADAR2 jest często związana z supresją guza. W raku wątroby, nadekspresja ADAR1 i obniżona ekspresja ADAR2 przewidują złe rokowanie i zwiększone ryzyko nawrotu pooperacyjnego, efekt przypisywany różnej selektywności w targetowaniu mRNA przez ADAR1/2. Rzeczywiście, zidentyfikowano kilka supresorów nowotworów jako cele ADAR2.

W porównaniu do ADAR1/2, niewiele badań rzuciło światło na potencjalną rolę ADAR3 w nowotworach. Ponieważ jest pozbawiony funkcjonalności edycji A-to-I, ADAR3 pośredniczy w swoim wpływie na nowotwór poprzez hamowanie edycji RNA, głównie edycji GRIA2 A-to-I zależnej od ADAR2 (substytucja glutaminy na argininę w pozycji 607) w glejakach i glejakach wielopostaciowych. Czy uważasz, że mechanizmy edycji RNA mogą stanowić nowy cel terapeutyczny w leczeniu nowotworów?

Edycja A-to-I wpływa również niekorzystnie na chemioterapię w nowotworach. Na przykład, ADAR1 kontroluje ekspresję reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), molekularnego celu leku antyfolanowego metotreksatu, poprzez edycję A-to-I miejsc wiązania miR-25-3p i miR-125a-3p w 3ʹ-UTR DHFR. W międzybłoniaku z dzikim typem białka 1 związanego z BRCA1 (BAP1), up-regulacja ADAR2 zwiększa edycję A-to-I transkryptów i 3ʹ-UTR. ADAR2 promuje ekspresję DHFR i splicing aktywnej syntazy folylopoliglutaminianowej (FPGS), które napędzają oporność na antyfolany. W konsekwencji, deplecja ADAR2 uwrażliwiła komórki międzybłoniaka na pemetreksed, chemioterapię antyfolanową pierwszej linii dla międzybłoniaka.

Niedawne badanie wykazało, że edycja A-to-I zależna od ADAR1 na 3ʹ-UTR desaturazy stearoilo-CoA (SCD1) zwiększa stabilność mRNA SCD1 w komórkach raka żołądka. Zwiększony SCD1 promuje tworzenie kropli lipidowych w celu złagodzenia stresu ER i zwiększenia macierzystości nowotworowej, prowadząc do chemooporności raka żołądka.

ADAR1 hamuje również ZEB1-zależną PANoptozę (zapalna ścieżka śmierci komórkowej) w celu promowania raka jelita grubego i czerniaka u myszy poprzez jego działanie na dsRNA. “Odkryliśmy, że zahamowanie ADAR1 może być kluczowym mechanizmem wzmacniającym odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom nowotworowym, co może prowadzić do rozwoju nowych strategii terapeutycznych” – komentują badacze.

Oprócz osłabiania odpowiedzi dsRNA, ADAR1 uwalnia immunosupresyjny lncRNA LINC00624 poprzez edycję A-to-I. LINC00624 hamuje prezentację antygenu MHC klasy I i ogranicza infiltrację limfocytów T CD8+ w mikrośrodowisku guza. Ponadto, LINC00624 propaguje pozytywny cykl feedforward, promując stabilizację ADAR1 poprzez hamowanie jego degradacji indukowanej ubikwitynacją za pośrednictwem białka zawierającego powtórzenie beta-transducyny (β-TrCP), prowadząc do oporności na ICB i leczenie anty-ludzkim receptorem czynnika wzrostu naskórka 2 (HER2).

Liczne wysiłki zostały podjęte w celu opracowania małocząsteczkowych inhibitorów enzymów A-to-I, szczególnie ADAR1. Przeprowadzono kompleksowy screening wysokoprzepustowy w celu identyfikacji potencjalnych inhibitorów ADAR1 i zidentyfikowano dwa związki, kwas litospermowy i regaloside B, które oddziałują z domeną Zα ADAR1, domeną funkcjonalną, która wiąże się z Z-RNA i Z-DNA. W innym badaniu wykazano, że alendronian, etidronian i zoledrionian hamują domenę Zα ADAR1 poprzez interakcję z Lys169, Lys170, Asn173 i Tyr177 domeny Zα w sposób podobny do helikalnego szkieletu Z-RNA.

Alternatywną strategią jest blokowanie eksportu jądrowego ADAR1p150, który głównie znajduje się w cytoplazmie, aby katalizować konwersję A-to-I. Ponieważ N-koniec ADAR1p150 zawiera NES, jak wspomniano powyżej, leczenie celujące w eksport jądrowy ADAR1p150, takie jak selektywne inhibitory eksportu jądrowego (NEI), okazało się korzystne w leczeniu nowotworów. NEI, takie jak leptomycyna B, Selinexor (KPT-330) i Eltanexor (KPT-8602), wykazują skuteczność przeciwnowotworową w modelach przedklinicznych. KPT-330 niedawno otrzymał zatwierdzenie FDA USA dla nawrotowego/opornego szpiczaka mnogiego.

Systemy CRISPR-Cas były szeroko stosowane do edycji i modyfikacji określonych nukleotydów na DNA i RNA. Wykorzystując regulatory A-to-I, zaproponowano szereg strategii manipulowania modyfikacją A-to-I w określonych miejscach RNA. Edycja RNA kierowana na określone miejsca przez ADAR celuje w określone transkrypty poprzez generowanie niedopasowań guanozyny. W przeciwieństwie do edycji DNA, edycja RNA A-to-I nie powoduje trwałej modyfikacji genomu gospodarza, co zapewnia znaczące korzyści dla bezpieczeństwa i łagodzi skutki uboczne edycji poza celem, które mogą wystąpić.

Czy nowe metody terapeutyczne oparte na modulacji procesów edycji RNA A-to-I mogą stanowić przełom w leczeniu nowotworów opornych na standardowe terapie? Jakie wyzwania mogą pojawić się przy wdrażaniu tych podejść do praktyki klinicznej?

Podsumowując, modyfikacja A-to-I odgrywa znaczącą rolę w rozwoju nowotworów. Regulatory RNA adenozynowej deaminazy, szczególnie ADAR, są nadekspresjonowane w guzach i nieprawidłowo katalizują modyfikację A-to-I, ostatecznie wpływając na ekspresję genów docelowych zaangażowanych w tumorogenezę lub modulację mikrośrodowiska guza. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw tych procesów może prowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych dla leczenia nowotworów.

Jakie znaczenie mają nowe strategie modulacji edycji RNA w praktyce klinicznej?

Wiele dowodów łączących nieprawidłową ekspresję A-to-I z nowotworami sugeruje, że opracowanie inhibitorów celujących w te szlaki będzie owocnym przedsięwzięciem. Regulator A-to-I ADAR1 jest znacząco nadekspresjonowany i promuje tumorogenezę w wielu typach nowotworów, a wysoka ekspresja ADAR1 często przewiduje złe przeżycie u tych pacjentów, podczas gdy ADAR2 częściej przypisuje się rolę supresora guza. Niemniej jednak, modyfikacja RNA A-to-I wydaje się działać jak miecz obosieczny w rozwoju guza, a funkcja ADAR1 i ADAR2 jest często specyficzna dla typu nowotworu i zależna od kontekstu.

Chociaż nasze zrozumienie biologii edycji A-to-I zapośredniczonej przez ADAR na mRNA i niekodującym RNA szybko się rozszerza, fizjologiczne i patologiczne znaczenie innych procesów edycji A-to-I, takich jak edycja A-to-I tRNA, dopiero zaczyna być badane. U ludzi doniesiono, że modyfikacje A-to-I, zarówno w pozycjach 34, jak i 37 tRNA^Ala, są ważne dla rozpoznawania autoprzeciwciał generowanych przeciwko pętli antykodonowej tRNA^Ala u pacjentów cierpiących na zapalenie mięśni, przewlekłe zapalne schorzenie mięśni. Jednak ich potencjalne role w tumorogenezie pozostają niezbadane.

Z perspektywy translacyjnej i klinicznej, interesujące będzie dalsze badanie zastosowania blokerów ADAR w leczeniu nowotworów i zwalczaniu chemooporności, szczególnie dla ADAR1, w świetle jego dominującego efektu pro-tumorogennego w wielu badaniach. W szczególności, połączenie inhibitorów ADAR1 z terapiami punktów kontrolnych immunologicznych w celu uwolnienia przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej jest innym obszarem aktywnych badań. “Nasze wyniki sugerują, że hamowanie ADAR1 może znacząco zwiększyć skuteczność immunoterapii poprzez aktywację szlaków rozpoznających dsRNA i wzmocnienie odpowiedzi przeciwnowotworowej” – wskazują badacze.

Niemniej jednak, rozwój inhibitorów specyficznych dla izoform ADAR jest nadal mało zbadany. Dodatkowe badania przedkliniczne będą potrzebne, aby ustalić skuteczność blokady ADAR dla poprawy terapii nowotworowej. Ponadto, czy ekspresja ADAR lub ich modyfikacje A-to-I downstream mogą być biomarkerami do przewidywania diagnozy lub prognozy nowotworowej również zasługują na dalsze badania.

Modyfikacja A-to-I jest zaangażowana w różnorodne procesy patologiczne, szczególnie tumorogenezę. Jednak nasze zrozumienie regulatorów modyfikacji A-to-I nie jest jeszcze kompleksowe. Do tej pory zidentyfikowano tylko dwie grupy kompleksów deaminaz, ADAR i ADAT, a wciąż pozostaje wiele pytań dotyczących złożonego procesu modyfikacji A-to-I.

Po pierwsze, nie jest jasne, czy edycja A-to-I jest dynamicznym i odwracalnym procesem, czy też istnieją odpowiednie wymazywacze, które regulują równowagę modyfikacji A-to-I. Po drugie, nie wiadomo, czy ADAT2/3 reguluje tumorogenezę, wpływając na preferencję użycia kodonów w całym genomie i wydajność translacji białek tRNA, jak wspomniano powyżej. Dodatkowo, ile nowych żywotnych kodonów można wygenerować poprzez ukierunkowaną edycję mRNA? Czy komórki używają tej strategii do modulowania różnorodności białek?

Ponieważ sieć potranskrypcyjna jest złożona, a różne regulatory są często połączone, warto zbadać, czy A-to-I i inne edycje potranskrypcyjne wpływają na siebie współpracując, aby odgrywać większą liczbę ról, szczególnie w guzach. Dalsze badania mechanistyczne są niezbędne, aby zacząć rozwikłać te tajemnice.

Kluczowym zagadnieniem dla klinicystów jest potencjalne wykorzystanie tej wiedzy w praktyce medycznej. Czy możemy spodziewać się w najbliższych latach pojawienia się terapii opartych na modulacji ADAR? Jakie biomarkery związane z edycją RNA mogłyby być przydatne w codziennej praktyce onkologicznej?

Badania nad rolą edycji A-to-I w nowotworach mają również istotne implikacje dla personalizacji leczenia. Różne typy nowotworów mogą wykazywać odmienne wzorce edycji RNA, co może wpływać na ich odpowiedź na leczenie. Na przykład, w przypadku pacjentów z wysoką ekspresją ADAR1 i zwiększoną edycją AZIN1, można rozważyć bardziej agresywne podejście terapeutyczne lub włączenie eksperymentalnych inhibitorów ADAR do schematu leczenia.

Ponadto, zrozumienie roli edycji A-to-I w modulacji odpowiedzi immunologicznej otwiera nowe możliwości dla immunoterapii. Połączenie inhibitorów ADAR1 z inhibitorami punktów kontrolnych immunologicznych może potencjalnie zwiększyć skuteczność immunoterapii u pacjentów, którzy w przeciwnym razie nie odpowiadaliby na takie leczenie.

Dla lekarzy klinicystów, ważne jest również zrozumienie, że modyfikacje A-to-I mogą wpływać na skuteczność standardowych chemioterapeutyków. Wiedza ta może pomóc w przewidywaniu odpowiedzi na leczenie i dostosowaniu schematów terapeutycznych. Na przykład, pacjenci z wysoką ekspresją ADAR1 mogą wykazywać oporność na metotreksat lub pemetreksed, co sugeruje potrzebę alternatywnych strategii leczenia.

W przyszłości, testy diagnostyczne oceniające poziomy ekspresji ADAR i wzorce edycji A-to-I mogą stać się standardem w profilowaniu molekularnym nowotworów, dostarczając cennych informacji prognostycznych i predykcyjnych. Takie testy mogłyby pomóc w stratyfikacji pacjentów do odpowiednich schematów leczenia i identyfikacji tych, którzy mogliby odnieść korzyści z terapii eksperymentalnych celujących w szlaki edycji RNA.

W miarę postępu badań nad edycją RNA A-to-I, możemy spodziewać się rozwoju nowych, bardziej selektywnych inhibitorów ADAR, które mogłyby być stosowane w monoterapii lub w kombinacji z istniejącymi lekami przeciwnowotworowymi. Ponadto, techniki ukierunkowanej edycji RNA, takie jak te oparte na systemach CRISPR, mogą umożliwić precyzyjną modyfikację określonych transkryptów w celu przywrócenia prawidłowej funkcji białek lub zahamowania ekspresji onkogenów.

Dla pacjentów onkologicznych, te postępy w zrozumieniu edycji RNA A-to-I i rozwoju terapii celowanych mogą ostatecznie prowadzić do bardziej skutecznych, mniej toksycznych opcji leczenia, które są dostosowane do specyficznego profilu molekularnego ich nowotworu.

Podsumowanie

Modyfikacja RNA typu A-to-I jest jedną z najważniejszych modyfikacji RNA, katalizowaną przez trzy główne grupy enzymów: ADAR, ADAT i ADAD. Proces ten ma fundamentalne znaczenie dla regulacji ekspresji genów i funkcjonowania różnych typów RNA. Szczególną rolę odgrywa w rozwoju nowotworów, gdzie ADAR1 często działa jako onkogen, podczas gdy ADAR2 wykazuje właściwości supresora nowotworowego. Zaburzenia w edycji A-to-I prowadzą do zmian w ekspresji genów związanych z nowotworzeniem oraz wpływają na odpowiedź na chemioterapię. Najnowsze badania koncentrują się na rozwoju inhibitorów ADAR oraz strategii terapeutycznych opartych na modulacji edycji RNA, co może stanowić przełom w leczeniu nowotworów. Szczególnie obiecujące wydaje się połączenie inhibitorów ADAR z immunoterapią oraz wykorzystanie technologii CRISPR do precyzyjnej edycji RNA.