Mikrobiota jelitowa kluczem do hamowania odpowiedzi autoimmunologicznej w SLE

Czy mikrobiota i jej metabolity kształtują odpowiedź autoimmunologiczną w SLE?

Bakteryjny metabolit hamuje odpowiedź autoimmunologiczną w toczniu rumieniowatym układowym poprzez modulację limfocytów B. Badania nad przeszczepem mikrobioty jelitowej otwierają nowe możliwości terapeutyczne w chorobach autoimmunologicznych.

Toczeń rumieniowaty układowy (SLE) to przewlekła i wysoce heterogenna choroba autoimmunologiczna, w której patogenezie kluczową rolę odgrywa nieprawidłowe różnicowanie i aktywacja limfocytów B oraz wydzielanie autoprzeciwciał. Podczas dojrzewania i ekspansji limfocytów B następuje nasilenie wydzielania przeciwciał, zwiększając skuteczność adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. W SLE zidentyfikowane autoprzeciwciała często wykazują wysokie powinowactwo i mutacje somatyczne w obrębie IgG, co wskazuje na ich powstawanie w centrach germinalnych, gdzie limfocyty T przyczyniają się do ułatwienia przełączania klas. Jednym z najpoważniejszych objawów narządowych SLE jest nefropatia toczniowa (LN), w której uszkodzenie nerek jest koordynowane przez autoreaktywne leukocyty, kompleksy immunologiczne oraz różne geny podatności związane z SLE i LN.

Mikrobiota jelitowa jest zaangażowana w modulowanie sieci metabolicznych i wpływa na patogenezę chorób autoimmunologicznych. Przeszczepienie materiału kałowego od pacjentów z SLE do myszy pozbawionych flory bakteryjnej (GF) wywołało u tych myszy różne cechy fenotypowe przypominające toczeń. “Transplantacja mikrobioty jelitowej z myszy MRL/lpr nasiliła patogenezę myszy z toczniem indukowanym prystanim i wpłynęła na profile komórek immunologicznych w jelicie” – piszą autorzy badania. Pacjenci z SLE wykazywali zmieniony metabolizm siarki i montaż wici, podczas gdy myszy podatne na toczeń z potrójnym kongenikiem wykazywały nieprawidłowy metabolizm tryptofanu, zaostrzający fenotypy autoimmunologiczne.

Metabolity purynowe pochodzące z mikrobioty stanowią silną kategorię związków immunomodulacyjnych, zdolnych do wpływania na różnicowanie regulatorowych limfocytów T (Treg), limfocytów pomocniczych typu 1 (Th1) i Th2, a także makrofagów zarówno w jelicie, jak i w regionach obwodowych. Probiotyki Lactobacillus reuteri zmieniały profil metabolomiczny i przywracały metabolit purynowy inozynę, redukując komórki Th1/Th2. Z kolei w obecności kofaktorów stymulujących, takich jak komórki dendrytyczne (DC) i receptor interleukiny 12 (IL-12), inozyna pochodząca z Bifidobacterium pseudolongum znacząco promowała komórki Th1, zwiększając skuteczność immunoterapii blokującej punkty kontrolne. Co istotne, oba efekty były uzależnione od aktywacji receptora adenozyny A2A.

W omawianym badaniu naukowcy odkryli wzbogacenie Lactobacillus johnsonii i metabolitów purynowych po skutecznym leczeniu przeszczepem mikrobioty kałowej (FMT) w mysich modelach tocznia. L. johnsonii wykazał silną korelację z metabolitami purynowymi. Inozyna, będąca najbardziej wyraźnie zwiększonym metabolitem pośrednim, złagodziła objawy podobne do tocznia, zmniejszając systemowo zróżnicowane limfocyty B i łagodząc LN. Cząsteczka inozyny odgrywa kluczową rolę jako centralny pośrednik zarówno w szlakach biosyntezy, jak i degradacji puryn. Inozyna hamuje różnicowanie limfocytów B poprzez uruchomienie kaskady sygnalizacyjnej ERK-HIF-1α. Monocolonizacja L. johnsonii prowadziła do znacznego wzrostu stężenia inozyny.

Jak FMT wpływa na mikrobiom i immunomodulację w modelach tocznia?

Aby zidentyfikować potencjalne zmiany mikrobioty w patogenezie tocznia, badacze przeprowadzili sekwencjonowanie 16S rDNA w celu dynamicznej analizy społeczności mikrobialnych w próbkach kału myszy MRL/lpr. Analiza poziomu przeciwciał anty-dwuniciowego DNA (dsDNA) i krążącego dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) potwierdziła postęp w patogenezie tocznia wraz z wiekiem u myszy MRL/lpr. Zaobserwowano wyraźną translokację bakteryjną w nerkach i węzłach chłonnych krezkowych (MLNs) u myszy w wieku 20 tygodni, co zbiegło się ze szczytową odpowiedzią autoimmunologiczną. Dalsze sekwencjonowanie 16S rDNA ujawniło dynamiczne zmiany w składzie mikrobiomu wraz z wiekiem, co potwierdzono na poziomie typu bakterii. W przeciwieństwie do tego, stosunek Firmicutes/Bacteroides (stosunek F/B) wykazał znaczny spadek między 10. a 15. tygodniem życia. Podobnie, typ Firmicutes wykazał wyraźny spadek, ale ze stopniowym wzrostem liczebności typu Desulfobacterota u myszy wraz z wiekiem.

Badacze określili następnie, czy zmiany w mikrobiocie jelitowej przyczyniają się do patogenezy autoimmunologicznej, lecząc myszy MRL/lpr koktajlem antybiotyków, który eliminował całą florę jelitową. Leczenie antybiotykami zmniejszyło przepuszczalność jelit i ograniczyło translokację bakterii zarówno do wątroby, jak i nerek, łagodząc jednocześnie objawy podobne do tocznia u myszy, w tym znaczne zmniejszenie poziomu białka w moczu i stosunku białka w moczu do kreatyniny. Chociaż poziomy przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) pozostały niezmienione, zaobserwowano wyraźne zmniejszenie przeciwciał anty-dsDNA w osoczu po leczeniu antybiotykami. Leczenie antybiotykami zmniejszyło rozmiar i wagę śledziony. Dodatkowo, zarówno kłębuszkowe zapalenie nerek, jak i infiltracja komórek immunologicznych w nerkach zostały złagodzone, wraz ze zmniejszoną odpowiedzią zapalną skóry po leczeniu antybiotykami.

Aby wykluczyć możliwość, że zmiany mikrobioty są specyficzne dla szczepu myszy MRL/lpr, badacze wykorzystali model myszy z toczniem indukowanym prystaniem, który dostarcza cennych informacji na temat roli interferonu typu I (IFN-I), genów stymulowanych przez IFN i czynników środowiskowych w indukcji tocznia. W porównaniu z 20-tygodniowymi myszami, 40-tygodniowe myszy wykazywały znacznie wyższe poziomy białka w moczu i przeciwciał anty-dsDNA, które są dwoma kluczowymi cechami wskazującymi na wystąpienie SLE. Sekwencjonowanie metagenomowe wykazało odrębne społeczności mikrobialne w kale myszy 20-tygodniowych i 40-tygodniowych. Na poziomie typu, zaobserwowano znaczący wzrost stosunku F/B u 40-tygodniowych myszy z toczniem, co kontrastuje z proporcjami obserwowanymi u zdrowych osób i pacjentów z SLE. Zaobserwowano również znaczącą nadreprezentację typów Actinobacteria i Verrucomicrobia u myszy z rozpoczynającym się toczniem.

Aby wybrać optymalnego dawcę FMT, przeprowadzono sekwencjonowanie 16S rDNA próbek mikrobioty kałowej od myszy C56BL/6j (C57) i MRL/mpj (mpj). Myszy C57 i mpj wykazywały odrębne wzorce mikrobioty kałowej bez oczywistych różnic w alfa-różnorodności. W porównaniu z myszami C57, dominującym rodzajem wzbogaconym u myszy mpj był Lactobacillus, a następnie zwiększony Rikenella i zmniejszony Clostridia_UCG-014. Rodzaj Lactobacillus obejmuje różne probiotyki znane z wywoływania znacznych zmian w składzie mikrobioty gospodarza i modulowania ogólnych funkcji metabolicznych mikrobiomów jelitowych. W konsekwencji mikrobiota kałowa od myszy mpj została wybrana jako dawca do FMT.

Mikrobiota kałowa od myszy mpj była podawana doustnie myszom zarówno z indukowanym prystaniem, jak i spontanicznym toczniem. Interwencja FMT trwała 24 tygodnie, aż do osiągnięcia stabilnego złagodzenia objawów podobnych do tocznia u myszy z toczniem indukowanym prystaniem. Co istotne, FMT dramatycznie zmniejszył poziomy białka w moczu, stosunek białka w moczu do kreatyniny oraz poziomy przeciwciał anty-dsDNA w modelach mysich tocznia. Podobną skuteczność ochronną przed toczniem zaobserwowano po 6-tygodniowym leczeniu FMT u myszy MRL/lpr.

Dodatkowo, zaobserwowano zauważalną redukcję komórek plazmatycznych i niższe poziomy depozycji IgG, IgG2a i C3 w nerkach w porównaniu do myszy leczonych solą fizjologiczną. Analiza histologiczna ujawniła, że interwencja FMT zmniejszyła infiltrację komórek immunologicznych, złagodziła kłębuszkowe zapalenie nerek i zmniejszyła zwłóknienie śródmiąższowe. U myszy MRL/lpr leczenie FMT spowodowało znaczny spadek częstości komórek Tfh i komórek Th1. Podsumowując, poprzez modulowanie autoimmunizacji, FMT skutecznie łagodziło objawy podobne do tocznia zarówno u myszy z indukowanym, jak i spontanicznym toczniem.

Jedno z kluczowych pytań dotyczy tego, czy przeszczep mikrobioty jelitowej wpłynął na autoimmunizację, oprócz wpływu na limfocyty T, limfocyty B i izotypy immunoglobulin, oraz zmiany repertuaru receptorów limfocytów T (TCR) i receptorów limfocytów B (BCR). Badacze przeprowadzili sekwencjonowanie repertuaru immunologicznego (IR) obejmujące wszystkie siedem łańcuchów TCR/BCR, w tym TCR alfa (TRA), TCR beta (TRB), TCR delta (TRD), TCR gamma (TRG), BCR ciężki (IGH), BCR kappa (IGK) i BCR lambda (IGL), co pozwoliło na kompleksową analizę składu BCR i TCR.

Jakie mechanizmy molekularne stoją za efektami FMT?

Całkowite poziomy ekspresji TCR i BCR nie wykazały oczywistych zmian IR między grupami FMT i kontrolnymi. Podczas gdy średnia długość regionów determinujących komplementarność (CDR3s) dla wszystkich czterech łańcuchów w TCR, a także IGK i IGL w BCR, pozostała niezmieniona przez leczenie FMT, wykryto krótszą średnią długość CDR3 w IGH BCR. Analiza równości Pielou ujawniła, że leczenie FMT doprowadziło do wzrostu różnorodności TRA i TRB oraz podwyższonej różnorodności IGL w porównaniu z myszami z toczniem leczonymi solą fizjologiczną.

Aby wizualizować skomplikowane zdarzenia somatycznej hipermutacji (SHM) i CSR w klonach IGH zarówno grup solnych, jak i FMT, stworzono diagramy sieciowe ilustrujące wszystkie klony IGH od reprezentatywnej myszy z toczniem. Każde kolorowe koło na diagramie reprezentuje specyficzny klon IGH, a wielkość koła odpowiada jego poziomowi ekspresji. Klony połączone krótkimi liniami wskazują, że różnią się tylko jednym aminokwasem w swojej strukturze pierwszorzędowej. Diagramy sieciowe żywo przedstawiają złożone procesy SHM i CSR w repertuarach IGH myszy indukowanych prystaniem leczonych solą fizjologiczną. W przeciwieństwie do tego, leczenie FMT wydawało się zmniejszać SHM i CSR, ponieważ zaobserwowano mniej połączonych połączeń między węzłami.

Ilościowa analiza na poziomie odczytu wykazała, że w przeciwieństwie do faktu, że IgA i IgG2 były dominującymi izotypami Ig u myszy indukowanych prystaniem leczonych solą fizjologiczną, leczenie FMT doprowadziło do znacznego wzrostu IgM i IgD. Na poziomie unikalnych CDR3 (uCDR3), leczenie FMT spowodowało znaczny spadek odsetka IgA i niewielki spadek IgG1, podczas gdy nastąpił znaczący wzrost IgD i IgM u myszy leczonych FMT, co jest zgodne z odkryciem, że FMT zwiększyło częstość naiwnych limfocytów B. Ponadto, w odniesieniu do częstości SHM wśród izotypów Ig BCR, leczenie FMT doprowadziło do zmniejszenia odsetka przełączonych izotypów klasy IGH, co wskazują zarówno liczby odczytów, jak i poziom uCDR3s.

Aby scharakteryzować heterogeniczność podzbiorów wewnątrznerkowych komórek zaangażowanych w ochronę nerek indukowaną przez FMT, przeprowadzono sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) w celu profilowania 19695 komórek nerkowych z próbek nerek wyciętych od myszy z toczniem leczonych FMT i kontroli leczonych solą fizjologiczną. Po zmapowaniu genów markerowych klastrów do ustalonych genów definiujących typ komórki, zidentyfikowano dziesięć typów komórek, w tym nefron, limfocyt B (B/plazmocyt B), limfocyt T, makrofagi i komórki dendrytyczne (Mac/DC), dystalny kanalik kręty (DCT), limfocyt T pamięci (Tm), komórka wtrącona (IC), komórka śródbłonka naczyniowego (vEC) i dublety wykazujące zarówno geny sygnaturowe limfocytów B, jak i nefronu.

Analiza składu komórkowego w różnych typach komórek wykazała redukcję B/plazmocytów B i Mac/DC po FMT. Zmiany w proporcjach komórek zostały dodatkowo potwierdzone w nerkach myszy z markerami kluczowych typów komórek: limfocyt B (Cd19), makrofagi (F4/80), DC (Cd11c). Limfocyty B i makrofagi konsekwentnie zmniejszyły się po leczeniu FMT. Ponadto, FMT dramatycznie zmieniło ekspresję genów w klastrach komórkowych, z obniżoną regulacją genów związanych z zapaleniem, w tym Cxcr4, Jak1 w klastrze komórek B; Ly6e, Cxcr3, Il7r w klastrze komórek T; Ly6c w klastrze Tm; S100a4, Cxcr4, Itga4, Ly6i, Il6ar w makrofagach. Wyniki te wskazują, że FMT hamuje odpowiedź zapalną w limfocytach T, B i makrofagach w nerkach myszy.

Wykazano, że infiltracja limfocytów B w biopsjach nerek u ludzi koreluje z ciężkością choroby toczniowej, udokumentowaną przez podwyższone poziomy kreatyniny, azotu mocznikowego we krwi i białka w moczu. “Rzeczywiście, w oparciu o ekspresję Gpr183 i Ccr7, które implikują migrację limfocytów B, zidentyfikowaliśmy klastry limfocytów B Gpr183^low Ccr7^high i Gpr183^high Ccr7^high, z których oba wykazały spadek proporcji komórek po FMT” – piszą badacze. Plazmocyty zostały zgrupowane i oznaczone przez kanoniczne markery, w tym Cd79a, Cd79b, Sdc1, Irf4 i Xbp1. Zauważono, że komórki B Gpr183^high ccr7^high wysoce ekspresjonowały Cd38, Pax5 i Bach2, które są genami charakterystycznymi dla dojrzałych limfocytów B pamięci. Zauważono również, że ten klaster komórek ekspresjonował wysoki poziom S1pr1, co implikowało wysoką zdolność migracji.

Analiza Gene Ontology (GO) różnicowych zmian genów w klastrze komórek B Gpr183^high Ccr7^high ujawniła, że FMT modulowało aktywność kinaz aktywowanych mitogenami (MAPK), migrację komórek jednojądrzastych, modyfikację histonów i różnicowanie komórek; podczas gdy klaster komórek B Gpr183^low Cc7^high był związany z regulacją formowania centrum germinalnego, różnicowaniem limfocytów T oraz przetwarzaniem i prezentacją antygenu. Ponadto, zidentyfikowano, że FMT obniżyło całkowity poziom ekspresji Ccr7, S1pr1 i Cd38, jednocześnie zwiększając Gpr183 i Ccr5.

Badacze następnie potwierdzili wpływ FMT na różnicowanie i migrację limfocytów B do nerek, analizując ekspresję Cd38, Ccr7, S1pr1 i Gpr183. Konsekwentnie, FMT znacząco zmniejszyło ekspresję mRNA Ccr7 i wykazało tendencję spadkową w poziomach mRNA Cd38, S1pr1 i Ebi2 w nerkach. Podsumowując, odkryto, że dominująca populacja limfocytów B u myszy indukowanych prystaniem składa się z komórek B Ccr7^high.

Czy interwencje probiotyczne i inozyna mogą rewolucjonizować terapię SLE?

Aby zbadać, czy zmiany w metabolitach purynowych były powiązane ze zmodulowaną mikrobiotą jelitową, przeprowadzono analizę korelacji między metabolitami zaangażowanymi w metabolizm purynowy a znacząco zróżnicowanymi szczepami mikrobialnymi. Należy zauważyć, że rodzaj Lactobacillus silnie korelował z metabolitami purynowymi. Wykryto również znaczący wzrost poziomu inozyny w osoczu po leczeniu FMT. Aby dalej ocenić związek między L. johnsonii a inozyną, myszy GF zostały monocolonizowane L. johnsonii. W rezultacie poziom inozyny w osoczu znacząco wzrósł. To ilustruje, że L. johnsonii ma zdolność do produkcji inozyny. Zaobserwowano również znaczący spadek poziomów inozyny w surowicy wśród pacjentów z SLE. Chociaż poziomy inozyny wykazywały negatywną korelację z wynikami Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index 2000 (SLEDAI-2K), ta relacja nie osiągnęła istotności statystycznej. Wyniki te wskazywały, że zmiana mikrobioty przyczyniła się do wzbogacenia metabolitów purynowych, co było związane z łagodzeniem autoimmunizacji.

Badacze następnie sprawdzili, czy podanie L. johnsonii lub związanej z nim inozyny jest wystarczające do ochrony myszy przed patogenezą tocznia. 15-tygodniowe podawanie L. johnsonii wykazało zwiększony poziom inozyny w osoczu u myszy indukowanych prystaniem. Dodatkowo, podawanie inozyny znacząco zwiększyło poziomy inozyny w osoczu, które były porównywalne z tymi po leczeniu FMT. Rzeczywiście, po 4-tygodniowym leczeniu inozyną nastąpiło znaczące zmniejszenie poziomów anty-dsDNA w porównaniu z grupą solną. Leczenie L. johnsonii osiągnęło podobną ochronę, chociaż redukcja poziomów autoprzeciwciał dsDNA nie osiągnęła istotności statystycznej. Podobnie do wyników FMT, profilowanie immunologiczne ujawniło tendencję wzrostową w naiwnych limfocytach T i tendencję spadkową w limfocytach T pamięci w komórkach T CD4+ i komórkach T CD8+ systemowo.

Leczenie inozyną i L. johnsonii znacząco zwiększyło odsetek naiwnych limfocytów B w węzłach chłonnych drenujących (DLNs) i wykazało tendencję spadkową w limfocytach B pamięci. Stwierdzono również znaczący spadek odsetka i liczby komórek GCB w grupach leczonych L. johnsonii i inozyną. L. johnsonii i inozyna poprawiły wynik patologiczny jelit cienkich. W jelitach cienkich, leczenie inozyną znacząco zwiększyło naiwne limfocyty B i zmniejszyło komórki wydzielające przeciwciała (ASCs) i GCB, podczas gdy zaobserwowano niewielki spadek w limfocytach B pamięci, ale nie osiągnął on istotności statystycznej. Ponadto, zaobserwowano znaczącą redukcję ASCs MLNs po leczeniu inozyną, wraz z niewielkim spadkiem w kępkach Peyera (PPs). Dodatkowo, leczenie L. johnsonii znacząco zwiększa częstość komórek Treg w limfocytach jelita cienkiego w porównaniu z grupą leczoną solą fizjologiczną. Ponadto, zaobserwowano, że integralność bariery jelitowej została poprawiona przez leczenie L. johnsonii.

W konsekwencji, zarówno inozyna, jak i L. johnsonii obniżyły poziomy białka w moczu u myszy z toczniem indukowanym prystaniem w porównaniu do grupy solnej. Stosunek białka w moczu do kreatyniny zmniejszył się po 13 tygodniach leczenia inozyną, z niewielkim spadkiem zauważonym również w grupie leczonej L. johnsonii po 13 tygodniach. Analiza histologiczna ujawniła, że interwencja L. johnsonii i inozyny zmniejszyła infiltrację komórek immunologicznych, złagodziła kłębuszkowe zapalenie nerek i zmniejszyła zwłóknienie śródmiąższowe. Wykryto niższe poziomy depozycji IgG, IgG2a i C3 w nerkach w porównaniu do myszy leczonych solą fizjologiczną. Leczenie L. johnsonii znacząco zmniejszyło poziom Cd38, Ccr7 i S1pr1 w nerkach, podczas gdy interwencja inozyną wykazała redukcję Ccr7 i Ebi2 w nerkach myszy. Obie interwencje wykazały również tendencję spadkową w ekspresji Cd19. Łącznie, dane te pokazały, że leczenie L. johnsonii i inozyną złagodziło LN u myszy indukowanych prystaniem.

Badacze następnie potwierdzili ochronne efekty L. johnsonii i inozyny u myszy MRL/lpr. Konsekwentnie, zarówno L. johnsonii, jak i inozyna zmniejszyły poziomy IgG anty-dsDNA, z niewielką redukcją poziomów białka w moczu w porównaniu z grupą solną. Analiza cytometrii przepływowej potwierdziła znaczący wzrost odsetka naiwnych limfocytów B po leczeniu L. johnsonii i inozyną. L. johnsonii znacząco zmniejszył odsetek ASCs, podczas gdy inozyna znacząco zmniejszyła plazmablasty u myszy MRL/lpr. Wyniki te łącznie sugerowały, że zarówno inozyna, jak i L. johnsonii mają silne działanie ochronne w hamowaniu odpowiedzi autoimmunologicznych poprzez hamowanie aktywacji i różnicowania limfocytów B.

Aby zbadać wpływ inozyny na odpowiedź limfocytów B specyficzną dla antygenu, badacze leczyli myszy C57BL/6j immunizowane hemocyjaniną z pąkli (KLH) solą fizjologiczną lub inozyną. Komórki immunologiczne i surowica zostały zebrane w 21 dniu po immunizacji. W porównaniu z grupą leczoną solą fizjologiczną, częstość komórek B220+ i CD19+ w śledzionie wykazała niewielki spadek po leczeniu inozyną. Dodatkowo, zaobserwowano wzrost naiwnych limfocytów T CD4+ w śledzionie myszy leczonych inozyną.

Ponadto, grupa leczona inozyną wykazała wyższą częstość naiwnych limfocytów B w węzłach chłonnych drenujących (DLNs) i niższą częstość limfocytów B pamięci w śledzionie i DLNs. Dodatkowo, leczenie inozyną znacząco zmniejszyło poziomy IgG1 specyficznego dla KLH w osoczu w dniu 14 i 21. Nadal, inne typy przeciwciał, w tym IgG2a, IgG2b, IgG3 i IgM, pozostały niezmienione w różnych punktach czasowych.

Następnie badacze zbadali mechanizmy leżące u podstaw wpływu inozyny na odporność limfocytów B. Mysie limfocyty B śledzionowe zostały wyizolowane i stymulowane IL-4 i agonistą TLR7/8 R848 w obecności różnych stężeń inozyny. Inozyna w sposób zależny od dawki zmniejszała częstość limfocytów B pamięci, z konsekwentnym wzrostem naiwnych limfocytów B. Inozyna znacząco zmniejszyła odsetek ASC przy dawce 1 mM i 10 mM. Podobnie, odsetek plazmablastów wykazał znaczący spadek po leczeniu inozyną w stężeniach 1 mM i 10 mM.

Konsekwentnie, stężenie IgG1 i IgM zostało znacząco zmniejszone przez leczenie inozyną 10 mM, a IgA również wykazało zauważalny spadek, chociaż nie osiągnęło istotności statystycznej. Poziomy mRNA cd38, bach2 i bcl2, które są związane z generowaniem limfocytów B pamięci, zostały znacząco zmniejszone w odpowiedzi na leczenie inozyną. Czynnik transkrypcyjny SPI-B jest kluczowy dla inicjacji centrum germinalnego (GC), podczas gdy PAX5 i IL-21R są odpowiedzialne za utrzymanie tożsamości komórek GCB lub promowanie różnicowania w limfocyty B pamięci. Zaobserwowano stopniowy spadek poziomów ekspresji il21r, spib i pax5 w limfocytach B leczonych zwiększonym stężeniem inozyny.

Dodatkowo, czynnik regulacyjny interferonu 4 (IRF4), który odgrywa rolę w promowaniu różnicowania komórek w plazmocyty, wykazał znaczący spadek po leczeniu inozyną w sposób zależny od dawki. Ponadto, inozyna zmniejszyła poziomy mRNA s1pr1, ebi2, ccr7 i ccr6, które są zaangażowane w migrację limfocytów B. Dlatego inozyna hamuje ekspresję zestawu krytycznych genów dla odporności limfocytów B. Wyniki te wykazały, że metabolit związany z L. johnsonii, inozyna, hamuje aktywację, różnicowanie i migrację limfocytów B in vitro.

Następnie badacze zbadali mechanizm, przez który inozyna ogranicza różnicowanie limfocytów B i migrację. Wykazano, że inozyna wiąże się z receptorem adenozyny 2A (A_2AR), receptorem znanym z wywierania hamującego wpływu na różnicowanie Th1. Poziomy mRNA A_2AR i A₃R stopniowo zmniejszały się wraz ze wzrostem stężenia inozyny, podczas gdy nie było znaczącego hamującego wpływu na poziomy mRNA A₁R i A_2BR. Jednak farmakologiczne hamowanie sygnalizacji A_2AR za pomocą ZM241385 nie zniosło efektu inozyny na różnicowanie limfocytów B, ani przez przepuszczalny dla komórek cykliczny AMP (db-cAMP), cząsteczkę sygnałową poniżej A_2AR. Dodatkowo, hamowanie kinazy białkowej A (PKA), cząsteczki efektorowej poniżej cAMP, wzmocniło hamujący wpływ inozyny na różnicowanie limfocytów B. Ponieważ szlak ssaczego celu rapamycyny (mTOR) jest znany z modulowania różnicowania limfocytów B, zbadano również, czy inozyna wpływała na limfocyty B poprzez mTOR. Podobnie, dodanie rapamycyny, znanego inhibitora mTORC1, również wzmocniło ograniczenie inozyny na różnicowanie limfocytów B. Łącznie, dane te wskazywały, że ani sygnalizacja A_2AR-cAMP-PKA, ani szlak mTOR nie są odpowiedzialne za ograniczenie przez inozynę różnicowania i migracji limfocytów B.

Badacze następnie zbadali alternatywne szlaki, przez które inozyna może wpływać na limfocyty B. Analiza western blot wykazała, że inozyna zmniejszyła poziomy fosforylowanego członka MAPK ERK1/2. Odwrotnie, zwiększyła poziom fosforylacji p38 MAPK. Jednak inhibitor p38 MAPK, SB 203580, promował wpływ funkcji inozyny na limfocyty B. Ponadto, poziomy fosforylacji kinazy białkowej B (AKT1), kinazy N-końcowej c-Jun (JNK) i czynnika jądrowego-kB p65 nie wykazały oczywistych zmian. Znaleziono wzbogacenie szlaku sygnalizacyjnego czynnika indukowanego hipoksją (HIF). Dalej zidentyfikowano różnicowo ekspresjonowane geny w szlaku sygnalizacyjnym HIF i odkryto, że hif1α znacząco zmniejszył się po leczeniu inozyną.

Zaobserwowano stopniowy spadek zarówno mRNA, jak i poziomów białka HIF-1α w limfocytach B wraz ze zwiększającym się stężeniem leczenia inozyną. Dodatkowo, inozyna również zmniejszyła ekspresję HIF-1α w ludzkich limfocytach B. Ponadto, inhibitor HIF-1α, LW6, znacząco zmniejszył odsetek ASC w mysich limfocytach B i ludzkich limfocytach B z krwi obwodowej, podczas gdy hamowanie HIF-1α w dużej mierze zniosło funkcję inozyny na limfocytach B. Dane te ujawniły, że efekty inozyny na limfocyty B były związane z modulowaniem HIF-1α. Leczenie inhibitorem ERK1/2 PD98059 spowodowało redukcję ekspresji HIF-1α w limfocytach B. Wyniki te sugerują, że selektywne hamowanie szlaków ERK-HIF-1α jest zaangażowane w supresję odporności limfocytów B mediowaną przez inozynę.

W tym badaniu wykazano, że FMT wywarło korzystny wpływ na autoimmunizację poprzez zmniejszenie CSR i podniesienie naiwnych izotypów IGH poprzez sekwencjonowanie BCR. Infiltracja limfocytów B w nerkach myszy została wyraźnie zmniejszona po odwróceniu dysbiozy mikrobialnej jelit, co przyczyniło się do złagodzenia LN. Sekwencjonowanie rDNA o wysokiej przepustowości ujawniło znaczące zmiany w strukturach mikrobiomu po FMT, charakteryzujące się wzrostem taksonów Lactobacillus, z L. johnsonii jako dominującym gatunkiem. Co ważne, L. johnsonii wykazał silną korelację z metabolitami purynowymi, szczególnie inozyną, jako najbardziej wyraźny wzrost po FMT. Podawanie inozyny skutecznie łagodziło objawy podobne do tocznia w modelach mysich poprzez hamowanie różnicowania limfocytów B, zmniejszenie wydzielania autoprzeciwciał i zmniejszenie infiltracji limfocytów B w nerkach. Mechanicznie, inozyna prawdopodobnie hamowała różnicowanie limfocytów B poprzez szlaki sygnalizacyjne ERK-HIF-1α.

Badanie to podkreśla odkrycie nowego metabolitu mikrobialnego, który hamuje autoimmunizację limfocytów B, torując drogę do innowacyjnych podejść terapeutycznych opartych na mikrobiomie. Wyniki te mają istotne implikacje dla lekarzy zajmujących się leczeniem chorób autoimmunologicznych, szczególnie SLE.

Podsumowanie

Naukowcy odkryli, że mikrobiota jelitowa odgrywa kluczową rolę w modulowaniu odpowiedzi autoimmunologicznej w toczniu rumieniowatym układowym (SLE). Badania wykazały, że przeszczep mikrobioty jelitowej (FMT) skutecznie łagodzi objawy choroby poprzez modyfikację składu bakterii jelitowych. Szczególnie istotne okazało się wzbogacenie bakterii Lactobacillus johnsonii, które produkują inozynę – metabolit hamujący nieprawidłową aktywację układu odpornościowego. Inozyna działa poprzez hamowanie różnicowania limfocytów B i zmniejszanie produkcji autoprzeciwciał, co prowadzi do złagodzenia objawów nefropatii toczniowej. Mechanizm działania inozyny opiera się na modulacji szlaków sygnałowych ERK-HIF-1α. Odkrycie to otwiera nowe możliwości terapeutyczne w leczeniu chorób autoimmunologicznych poprzez celowane interwencje w mikrobiom jelitowy oraz potencjalne wykorzystanie probiotyków i metabolitów bakteryjnych jako innowacyjnych leków.