IMP eliminuje superbakterie oporne na kolistynę i karbapenemy

Czy IMP może być odpowiedzią na rosnącą oporność bakterii?

Oporność na antybiotyki stała się globalnym zagrożeniem zdrowia publicznego – szacuje się, że do 2050 roku może spowodować ponad 39 milionów zgonów. Kolistyna i karbapenemy to kluczowe antybiotyki ostatniej szansy w walce z zakażeniami bakteryjnymi, jednak ich skuteczność drastycznie maleje z powodu pojawienia się genów oporności mcr-1 i bla_NDM-1. Gen mcr-1 koduje fosfoetanoloaminotransferazę, która modyfikuje lipid A, uniemożliwiając wiązanie kolistyny. Bakterie niosące bla_NDM-1 hydrolizują niemal wszystkie antybiotyki β-laktamowe, w tym karbapenemy. Współwystępowanie obu genów w patogenach takich jak E. coli i K. pneumoniae stanowi poważne wyzwanie terapeutyczne.

Coraz więcej dowodów wskazuje na ścisły związek między metabolizmem bakteryjnym a skutecznością antybiotyków. Badania pokazują, że suplementacja egzogennymi metabolitami – takimi jak glukoza, alanina czy kwas fumarowy – może przywracać wrażliwość opornych patogenów. W niniejszym badaniu naukowcy zastosowali profilowanie metabolomiczne, aby zidentyfikować różnice metaboliczne między szczepami wrażliwymi a opornymi (niosącymi mcr-1, bla_NDM-1 lub oba geny) i na tej podstawie odkryli potencjalny kandydat bakteriobójczy – inozynomonofosforan (IMP).

Jak przeprowadzono badanie nad działaniem IMP?

Badacze wykorzystali szczepy rekombinowane E. coli DH5α z dobrze scharakteryzowanym tłem genetycznym: DH5α-pACYC184 (kontrola), DH5α-mcr-1, DH5α-bla_NDM-1 oraz DH5α-mcr-1/bla_NDM-1. Dodatkowo testowano trzy izolaty kliniczne: E. coli 2F-2 (niosący mcr-1), E. coli WT20 (niosący bla_NDM-1) oraz E. coli 242 (niosący oba geny). Profilowanie metabolomiczne przeprowadzono za pomocą spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości (Q Exactive), a dane analizowano z użyciem Progenesis QI i MetaboAnalyst 5.0.

Minimalne stężenie hamujące (MIC) metabolitów purynowych – w tym IMP, inozyny, hipoksantyny i ksantozyny – zmierzono metodą mikrodylucji szachownicowej. Krzywe zabijania bakterii oceniono w przedziałach czasowych 0–24 godzin przy różnych stężeniach IMP (5, 10, 15, 20 mM). Wpływ IMP na błonę komórkową badano za pomocą sond fluorescencyjnych (1-N-fenylonaftylenoamina, jodek propidyny, Laurdan), oceniając przepuszczalność, płynność oraz siłę protonomotoryczną (PMF). Morfologię bakterii wizualizowano przy użyciu skaningowej (SEM) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

W modelu in vivo myszy BALB/C zakażono śmiertelną dawką E. coli 242 lub 2F-2 (2×10⁸ CFU/mL), a następnie leczono IMP (50 lub 100 mg/kg) lub antybiotykami (kolistyna, meropenem). Po 20 godzinach oceniono obciążenie bakteryjne w narządach (wątroba, śledziona, płuca, nerki) oraz przeżywalność przez 7 dni.

Jakie zmiany metaboliczne wywołują geny oporności?

Analiza metabolomiczna wykazała, że ekspresja genów mcr-1 i bla_NDM-1 istotnie zmienia profil metaboliczny E. coli. W porównaniu do szczepu wrażliwego DH5α-pACYC184, szczepy niosące mcr-1, bla_NDM-1 oraz oba geny wykazały odpowiednio 41, 53 i 47 różnicujących metabolitów. Spośród nich zidentyfikowano 9 wspólnych metabolitów – 2 o zwiększonej, a 7 o obniżonej zawartości.

Najbardziej znaczące zmiany dotyczyły szlaku purynowego: hipoksantyna (spadek 1,7–25,1-krotny), ksantozyna (1,7–5,7-krotny), IMP (15,1–47,5-krotny) oraz inozyna (4,1–51,9-krotny). Szlak purynowy okazał się najbardziej zaburzonym szlakiem metabolicznym po wprowadzeniu genów oporności. Dodatkowo, ekspresja mcr-1 i bla_NDM-1 wpłynęła na metabolizm rybofławiny, fosforylację oksydacyjną oraz transportery ABC.

“Nasze wyniki sugerują, że metabolizm purynowy stanowi kluczowy element adaptacji metabolicznej bakterii do ekspresji genów oporności” – piszą autorzy badania.

Jak skutecznie IMP eliminuje oporne bakterie?

Spośród czterech testowanych metabolitów purynowych wyłącznie IMP wykazał działanie bakteriobójcze wobec szczepów niosących mcr-1, bla_NDM-1 lub oba geny, z wartością MIC wynoszącą 10 mM. Krzywe zabijania bakterii pokazały, że 10 mM IMP hamuje wzrost bakterii, natomiast 20 mM IMP eliminuje oporne szczepy w ciągu 3–6 godzin, pozostawiając niewiele lub żadnych przeżywalnych kolonii. Co istotne, po 30 pasażach nie zaobserwowano rozwoju oporności na IMP.

W modelu zapalenia otrzewnej u myszy zakażonych E. coli 242 (niosący mcr-1 i bla_NDM-1) lub E. coli 2F-2 (niosący mcr-1), leczenie antybiotykami (kolistyna, meropenem) nie przyniosło znaczącej redukcji obciążenia bakteryjnego. Natomiast IMP w dawce 100 mg/kg spowodował ponad 10-krotne zmniejszenie liczby bakterii w wątrobie, śledzionie, płucach i nerkach. Co więcej, IMP znacząco złagodziło uszkodzenia histopatologiczne wywołane zakażeniem.

Pod względem przeżywalności, myszy zakażone E. coli 242 lub 2F-2 i leczone PBS lub antybiotykami umierały w ciągu 3 dni. Tymczasem leczenie IMP zwiększyło przeżywalność odpowiednio do 50,0% i 66,7%.

W jaki sposób IMP niszczy bakterie?

IMP wywiera wielokierunkowe działanie niszczące integralność błony komórkowej bakterii. Badania wykazały, że IMP znacząco zwiększa przepuszczalność zarówno błony wewnętrznej, jak i zewnętrznej w sposób zależny od dawki. Ponadto, stosowanie sondy fluorescencyjnej Laurdan ujawniło, że IMP indukuje nieprawidłowy wzrost płynności błony. Przy wysokich stężeniach IMP hydrofobowość powierzchni komórkowej DH5α-mcr-1/bla_NDM-1 wzrosła ponad 4,3-krotnie, a DH5α-mcr-1 – 3,5-krotnie.

Siła protonomotoryczna (PMF), składająca się z gradientu pH (ΔpH) i potencjału błonowego (Δψ), odgrywa kluczową rolę w metabolizmie energetycznym związanym z błoną. IMP powodował wzrost zarówno ΔpH, jak i Δψ w sposób zależny od dawki. Te szkodliwe efekty na błonę komórkową i ścianę komórkową głęboko naruszyły integralność bakterii, prowadząc do masywnego wycieku materiałów wewnątrzkomórkowych, takich jak białka, jony Na⁺ i K⁺. Obserwacje mikroskopowe (SEM i TEM) ujawniły różnorodne nieprawidłowości morfologiczne: pomarszczoną cytoplazmę, niewyraźne granice ściany komórkowej oraz liczne wakuole.

Poza uszkodzeniem błony, IMP zaburza metabolizm energetyczny bakterii. Nieprawidłowa PMF bezpośrednio indukuje dysfunkcję łańcucha oddechowego i hamuje produkcję ATP. IMP (8 mM) drastycznie zmniejszyło redukcję INT o ponad 75% w obu szczepach (DH5α-mcr-1/bla_NDM-1 – 82,1%; DH5α-mcr-1 – 75,3%), co wskazuje na zahamowanie aktywności transportu elektronów. Ponadto, zmniejszone zużycie tlenu dodatkowo potwierdziło zakłócenie oddychania tlenowego bakterii.

Leczenie IMP nie tylko spowodowało wyczerpanie ATP o ponad 60% w obu szczepach, ale także znacząco zwiększyło stężenie ATP pozakomórkowego (ponad 10-krotnie w porównaniu z kontrolą), co łącznie przyczyniło się do niemal 40–50% spadku ogólnego poziomu ATP w opornych szczepach E. coli. Nieprawidłowa aktywność oddechowa często koreluje z nieprawidłowymi stosunkami NADH/NAD⁺ i poziomami reaktywnych form tlenu (ROS). IMP znacząco podniósł stosunek NADH/NAD⁺ o 18–50-krotnie w porównaniu z komórkami niepoddanymi leczeniu, co odpowiada ponad 40% utracie aktywności kompleksu I łańcucha oddechowego bakterii.

Jak IMP wywołuje stres oksydacyjny i uszkodzenia białek?

Zwiększony stosunek NADH/NAD⁺ często towarzyszy nadprodukcji reaktywnych form tlenu (ROS), co potwierdzono w niniejszym badaniu. IMP jednocześnie promował akumulację ROS, takich jak ·O₂^–, H₂O₂ i ·OH. Ponadto, podanie IMP nieznacznie zmniejszyło aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) o około 6% w szczepach DH5α-mcr-1/bla_NDM-1 i DH5α-mcr-1.

Dzięki podwójnemu efektowi zwiększonej produkcji ROS i osłabionego systemu antyoksydacyjnego, IMP skutecznie zwiększył zawartość karbonylowanych białek o 1,77–4,13-krotnie w stosunku do komórek niepoddanych leczeniu. Karbonylacja reszt argininy, lizyny i proliny może indukować niestabilność białek i nieodwracalnie uszkadzać ich struktury. Jako wykonawcy procesów życiowych, uszkodzone białka prowadziłyby do szeroko zakrojonej dysfunkcji bakteryjnej, ostatecznie prowadząc do śmierci komórki.

Analiza transkryptomiczna wykazała, że IMP zmienił profil transkrypcyjny DH5α-mcr-1/bla_NDM-1, z 224 genami o zwiększonej i 296 genami o obniżonej ekspresji (>1,5-krotnie). Wiele genów związanych ze składem błony bakteryjnej wykazało wyraźne zmiany, takie jak yaiY, yebE, lolA i ompWXF. IMP spowodował szeroką redukcję poziomów transkrypcyjnych genów związanych z transporterami ABC, zwłaszcza tych zaangażowanych w transport sn-glicerolo-3-fosforanu (ugpA, ugpB, ugpC, ugpE).

Co istotne, IMP hamował transkrypcję wielu genów zaangażowanych w odpowiedź antyoksydacyjną, w szczególności systemów GSH-Grx i Trx, które odgrywają kluczową rolę w ochronie komórek przed uszkodzeniem oksydacyjnym. Obniżony system obronny może nasilać utlenianie nukleotydów, destabilizować integralność informacji genetycznej i aktywować transkrypcję kilku genów naprawczych, takich jak alkA, mutY i ligB, aby złagodzić uszkodzenia oksydacyjne.

Czy IMP może stać się nowym narzędziem w walce z superbakteriami?

Badanie wykazało, że inozynomonofosforan (IMP) – metabolit z szlaku purynowego – stanowi obiecującego kandydata na lek przeciwbakteryjny wobec szczepów E. coli niosących geny oporności mcr-1 i bla_NDM-1. IMP działa szybko i wielokierunkowo: niszczy integralność błony komórkowej, zaburza metabolizm energetyczny, indukuje stres oksydacyjny i prowadzi do masywnego wycieku substancji wewnątrzkomórkowych oraz uszkodzenia białek. W modelu zwierzęcym IMP w dawce 100 mg/kg znacząco zmniejszył obciążenie bakteryjne w narządach i zwiększył przeżywalność myszy do 50–66,7%, podczas gdy standardowa terapia antybiotykowa była nieskuteczna.

Pomimo obiecujących wyników, autorzy podkreślają konieczność dalszych badań. Nie ustalono jeszcze pełnego profilu bezpieczeństwa IMP ani szczegółowych badań farmakokinetycznych (absorpcja, dystrybucja, metabolizm, wydalanie). Badania przeprowadzono na niewielkich grupach zwierząt (n=6), co wymaga potwierdzenia w większych badaniach przedklinicznych i klinicznych. Niemniej jednak, IMP wykazuje niskie ryzyko rozwoju oporności i nie wykazał toksyczności w wstępnych testach (dawka 5000 mg/kg nie spowodowała zgonów ani nieprawidłowości behawioralnych u myszy).

Odkrycie IMP jako potencjalnego leku przeciwbakteryjnego otwiera nową ścieżkę w poszukiwaniu związków przeciwdrobnoustrojowych przeciwdziałających rosnącej oporności na kolistynę i karbapenemy. IMP może znaleźć zastosowanie w leczeniu krytycznych zakażeń wywołanych przez oporne szczepy E. coli, zwłaszcza u pacjentów, u których dotychczasowa terapia jest nieskuteczna. Dalsze badania są niezbędne, aby w pełni ocenić jego potencjał kliniczny i bezpieczeństwo stosowania u ludzi.