GuaB jako nowy cel w leczeniu zakażeń układu moczowego

Czy UPEC jest naprawdę niepokonany?

Uropathogenne Escherichia coli (UPEC) są głównym czynnikiem wywołującym zakażenia układu moczowego (UTI), odpowiadając za ponad 80% wszystkich przypadków. Jednym z największych wyzwań w leczeniu UTI wywołanych przez UPEC jest wysoka częstość nawrotów – około 25% pacjentów doświadcza nawrotu w ciągu 6 miesięcy, nawet po zastosowaniu antybiotykoterapii. Dodatkowo, rozprzestrzenianie się szczepów opornych na antybiotyki, w tym szczepów opornych na chinolony oraz wytwarzających beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum, stanowi poważny problem kliniczny. Te kwestie podkreślają pilną potrzebę opracowania nowych strategii terapeutycznych.

Dobrze udokumentowano, że rzęski typu 1, wici oraz systemy pozyskiwania żelaza są kluczowymi czynnikami wirulencji, które przyczyniają się do zdolności UPEC do ustanowienia i podtrzymania infekcji w pęcherzu moczowym. Rzęski typu 1 są dominującymi strukturami rzęskowymi UPEC i są niezbędne do przylegania bakterii i inwazji komórek nabłonka pęcherza. Wici zwiększają sprawność bakterii w środowisku pęcherza, promują tworzenie mikrokolonii i ułatwiają wstępujący ruch bakterii z pęcherza do nerek. W pęcherzu UPEC konkuruje z komórkami gospodarza o ograniczoną dostępność żelaza, co sprawia, że efektywne pozyskiwanie żelaza jest kluczowe dla wzrostu bakterii i przeżycia w tej niszy.

Czy nowe cele molekularne zmienią podejście terapeutyczne?

Badacze z Japonii podjęli się zidentyfikowania nowych potencjalnych celów molekularnych dla rozwoju leków przeciwbakteryjnych. W przeciwieństwie do dobrze scharakteryzowanych celów, takich jak rybosomy, enzymy syntezy ściany komórkowej czy białka związane z syntezą kwasów nukleinowych, odkrycie nowych celów mogłoby ułatwić opracowanie innowacyjnych środków przeciwdrobnoustrojowych o zwiększonej skuteczności, szczególnie wobec szczepów opornych na leki.

Podobnie jak wiele innych gatunków bakterii, UPEC posiada zdolność syntezy monofosforanu guanozyny (GMP) i monofosforanu adenozyny (AMP), prekursorów nukleotydów purynowych guaniny i adeniny, z rybozo-5-fosforanu poprzez inozyno-5′-monofosforan (IMP). Ten szlak jest znany jako biosynteza puryn de novo. Wcześniejsze badania wykazały, że biosynteza puryn de novo przyczynia się do wewnątrzkomórkowego przeżycia i proliferacji UPEC w komórkach nabłonka pęcherza.

Jak badania ujawniają tajemnice patogenności UPEC?

W prezentowanym badaniu naukowcy zastosowali nowatorskie podejście, koncentrując się na identyfikacji białek, które są wysoce ekspresjonowane przez UPEC podczas infekcji pęcherza moczowego. Wykorzystali mysie modele UTI, zakażając je przezcewkowo szczepem UPEC, a następnie pobierając bakterie związane z pęcherzem 48 godzin po zakażeniu do profilowania proteomicznego. “Naszym celem było zidentyfikowanie białek, które są wysoce ekspresjonowane podczas infekcji pęcherza moczowego i przyczyniają się do patogenności UPEC” – piszą autorzy badania.

Analiza ujawniła zestaw białek, w tym białka rybosomalne i chaperony, a także co najmniej 31 kandydujących białek. Aby ocenić ich rolę w patogenezie, skonstruowano mutanty z delecją genów odpowiadających tym kandydującym białkom i oceniono ich wpływ na wirulencję UPEC. Wśród nich zidentyfikowano GuaB (dehydrogenazę inozyno-5′-monofosforanową, IMPDH), kluczowy enzym w szlaku de novo biosyntezy puryn zaangażowany w syntezę GMP, jako krytyczny czynnik patogenności UPEC w pęcherzu moczowym.

Badacze wykazali, że mutant guaB wykazywał znacznie zmniejszoną zdolność do kolonizacji pęcherza moczowego w porównaniu do szczepu rodzicielskiego, z liczbą bakterii ponad 1000-krotnie niższą. Co istotne, mutant guaB nie był w stanie rosnąć w modyfikowanym sztucznym medium moczu (mAUM), które naśladuje środowisko moczowe. Ten defekt wzrostu został naprawiony przez komplementację plazmidem ekspresyjnym guaB lub przez suplementację mAUM ksantyną lub GMP.

GuaB katalizuje konwersję inozyno-5′-monofosforanu (IMP) do ksantozyno-5′-fosforanu (XMP), który następnie jest przekształcany w GMP przez produkt genu guaA. Suplementacja mAUM ksantyną lub GMP przywróciła wzrost mutanta guaB, wskazując, że defekt wzrostu wynika z niewystarczającej biosyntezy GMP.

Testy inwazyjności wykazały, że liczba wewnątrzkomórkowych bakterii mutanta guaB była około jedną trzecią liczby szczepu rodzicielskiego, podczas gdy komplementacja przywróciła inwazję do poziomu rodzicielskiego. Wyniki te wskazują, że GuaB jest ważny dla wzrostu UPEC w moczu i jego zdolności do przylegania i inwazji komórek dróg moczowych.

Jak mocz wpływa na ekspresję kluczowych genów?

Badacze sprawdzili również, czy delecja guaB wpływa na inne znane czynniki wirulencji UPEC. Ocenili zależną od wici ruchliwość oraz aktywność hemolizyny między szczepem rodzicielskim a mutantem guaB, mierząc rozprzestrzenianie się bakterii na miękkim podłożu agarowym i wielkość pierścienia hemolitycznego na płytkach agarowych zawierających owczą krew. Nie zaobserwowano jednak znaczących różnic w ruchliwości wici ani aktywności hemolitycznej między szczepem rodzicielskim a mutantem guaB. To sugeruje, że GuaB specyficznie wpływa na zdolność UPEC do wzrostu w środowisku moczowym i inwazji komórek gospodarza, nie zakłócając innych mechanizmów wirulencji.

Interesującym odkryciem było to, że ekspresja genów guaB i guaA była wyższa w mAUM niż w standardowym medium laboratoryjnym LB. Badacze wykazali, że promotor guaB/A wykazuje wyższą aktywność w mAUM, a dodanie mocznika w stężeniu fizjologicznym indukowało znaczący wzrost aktywności promotora guaB/A. Sugeruje to, że ekspresja GuaB jest regulowana w górę przez fizjologiczne stężenia mocznika, podkreślając jego znaczenie w patogenezie UPEC w drogach moczowych.

Aktywność promotora guaB/A jest regulowana przez czynniki transkrypcyjne Fis, DnaA, PurR i CRP. Analiza transkrypcyjna nie wykazała znaczących zmian w ekspresji fis, dnaA lub crp między dwoma mediami, podczas gdy ekspresja purR była podwyższona w mAUM. Ponieważ PurR działa jako represor transkrypcji guaB/A, jego regulacja w górę powinna raczej tłumić, niż wzmacniać ekspresję guaB/A. Dlatego PurR prawdopodobnie nie pośredniczy w obserwowanej indukcji.

Podczas analizy PCR w czasie rzeczywistym badacze odkryli, że poziom transkrypcji glpT, jednego z genów, których transkrypcja jest aktywowana przez CRP, był znacząco niższy w hodowli mAUM w porównaniu do medium LB. W przeciwieństwie do glpT, CRP hamuje transkrypcję guaB/A. Wiadomo, że aktywność CRP jest modulowana przez wewnątrzkomórkowe poziomy cAMP. Badacze postawili hipotezę, że zmniejszone poziomy cAMP mogą leżeć u podstaw zwiększonej ekspresji guaB/A. Rzeczywiście, odkryli, że wewnątrzkomórkowe poziomy cAMP w mAUM były około dwukrotnie niższe niż w medium LB, co potwierdza ideę, że zmniejszona represja zapośredniczona przez CRP zwiększa ekspresję guaB/A.

Wśród składników moczu znajdują się substancje takie jak mocznik, kwas moczowy i kreatynina. Aby zbadać wpływ tych składników na ekspresję guaB/A, badacze hodowali UPEC zawierający plazmid pNNguaB-P w medium LB suplementowanym wyżej wymienionymi związkami i mierzyli aktywność promotora guaB/A. Wśród nich tylko 170 mM mocznik – zgodnie z typowymi stężeniami w moczu – indukował znaczący wzrost aktywności promotora guaB/A. Promotor guaB/A podlega kontroli zależnej od tempa wzrostu. Porównanie wzrostu bakterii z i bez mocznika wykazało, że stężenie mocznika użyte w tym badaniu nie wpłynęło na wzrost bakterii. Wyniki te wskazują, że ekspresja GuaB jest regulowana w górę przez fizjologiczne stężenia mocznika, podkreślając jego znaczenie w patogenezie UPEC w drogach moczowych.

Czy GuaB otwiera drogę do nowych terapii przeciwko UTI?

Czy odkrycie roli GuaB w patogenezie UPEC może prowadzić do nowych strategii terapeutycznych? Badacze sugerują, że IMPDH może być obiecującym celem dla rozwoju nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. IMPDH jest zachowany zarówno u eukariontów, jak i prokariontów, a jego dysfunkcja ma głęboki wpływ, szczególnie na szybko dzielące się komórki. W eukariontach IMPDH jest już celem terapii immunosupresyjnej, leczenia nowotworów i chemioterapii przeciwwirusowej, co doprowadziło do opracowania różnych inhibitorów IMPDH, takich jak kwas mykofenolowy, mizoribina, tiazofuryna, merimepodib, 5-etynylo-1-beta-d-rybofuranozyloimmidazolo-4-karboksamid (EICAR) i rybawiryna.

Szybki podział komórek jest również cechą charakterystyczną większości komórek bakteryjnych, a w ostatnich latach IMPDH zyskał uwagę jako potencjalny cel chemioterapii przeciwbakteryjnej. Jednak wiele bakterii może syntetyzować GMP nawet przy braku aktywności IMPDH poprzez odzyskiwanie związków purynowych, takich jak guanina, ksantyna, ksantozyna i guanozyna ze środowiska. Ten szlak ratunkowy może nadawać oporność na inhibitory IMPDH. Skuteczność inhibitorów IMPDH zależy zatem od dostępności tych źródeł puryn w określonych niszach środowiskowych, takich jak miejsca infekcji, a także od specyficzności transporterów i enzymów zaangażowanych w ich pobieranie i metabolizm.

Chociaż istnieją różnice strukturalne między eukariotycznymi i bakteryjnymi IMPDH, konieczne jest zidentyfikowanie wysoce selektywnych związków, które specyficznie hamują bakteryjne IMPDH. Aby sprostać tym wyzwaniom, ostatnie badania zidentyfikowały obiecujące związki hamujące przeciwko kilku gatunkom bakterii, które budzą obawy kliniczne z powodu rozprzestrzeniania się oporności wielolekowej, w tym Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter spp. W obecnym badaniu badacze wykazują, że aktywność GuaB jest niezbędna do wzrostu UPEC w moczu. Wyniki te sugerują, że hamowanie IMPDH mogłoby być skuteczną strategią terapeutyczną przeciwko UTI wywołanym przez UPEC.

Spektrometria mas w tym badaniu zidentyfikowała nie tylko GuaB, ale także białka wcześniej znane jako kluczowe dla ustanowienia i utrzymania infekcji UPEC, takie jak białko błony zewnętrznej OmpA i białka zaangażowane w systemy pozyskiwania żelaza. Te odkrycia demonstrują skuteczność podejścia badawczego w identyfikacji nowych celów. Jednak ponieważ bakterie kolonizujące pęcherz były zbierane razem z całym pęcherzem myszy do analizy białek, znaczna część wykrytych białek pochodziła z tkanki gospodarza. To ograniczyło czułość wykrywania białek bakteryjnych. Przyszłe udoskonalenia metodologiczne, takie jak selektywna izolacja białek bakteryjnych, powinny zwiększyć czułość i umożliwić bardziej kompleksową identyfikację białek spełniających określone kryteria.

Badanie to przyczynia się do rozwoju wszechstronnej platformy badawczej, która mogłaby zostać zaadaptowana do identyfikacji nowych celów terapeutycznych również w innych patogenach. W obliczu rosnącej oporności na antybiotyki, odkrycie nowych celów molekularnych dla rozwoju leków przeciwbakteryjnych jest kluczowe dla przyszłości leczenia infekcji.

Podsumowując, badanie to podkreśla znaczenie GuaB jako krytycznego czynnika patogenności UPEC w pęcherzu moczowym i sugeruje, że inhibitory IMPDH mogą stanowić obiecującą nową klasę środków przeciwdrobnoustrojowych do leczenia UTI wywołanych przez UPEC. Czy w przyszłości zobaczymy nowe terapie celujące w szlak biosyntezy puryn? Wyniki te z pewnością otwierają nowe możliwości w walce z opornymi na antybiotyki zakażeniami układu moczowego.

Podsumowanie

Badania japońskich naukowców ujawniły kluczową rolę enzymu GuaB (dehydrogenazy inozyno-5′-monofosforanowej) w patogenezie uropatogennej bakterii Escherichia coli (UPEC). UPEC jest odpowiedzialny za ponad 80% zakażeń układu moczowego, a rosnąca oporność na antybiotyki stanowi poważne wyzwanie terapeutyczne. Badacze wykazali, że GuaB jest niezbędny do wzrostu UPEC w moczu oraz jego zdolności do kolonizacji pęcherza moczowego. Ekspresja genu guaB jest regulowana przez fizjologiczne stężenia mocznika, co podkreśla jego znaczenie w patogenezie. Odkrycie to sugeruje, że inhibitory IMPDH mogą stanowić nową klasę leków przeciwdrobnoustrojowych w leczeniu zakażeń układu moczowego wywołanych przez UPEC. Jest to szczególnie istotne w kontekście rosnącej oporności na obecnie stosowane antybiotyki.